Транскрипция

Общие сведения

Транскрипция - процесс синтеза РНК с использованием ДНК в качестве матрицы, происходящий во всех живых клетках. Другими словами, это перенос генетической информации с ДНК на РНК.
В процессе транскрипции генов происходит биосинтез молекул РНК, комплементарных одной из цепей матричной ДНК, сопровождаемый полимеризацией четырех рибонуклеозидтрифосфатов (ATP, GTP, CTP и UTP) с образованием 3"–5"-фосфодиэфирных связей и освобождением неорганического пирофосфата.
Транскрипция катализируется ферментом ДНК-зависимой РНК-полимеразой . Процесс синтеза РНК протекает в направлении от 5"- к 3"- концу, то есть по матричной цепи ДНК РНК-полимераза движется в направлении 3"->5"
РНК-полимеразы могут состоять из одной или нескальких субъединиц. У митохондрий и некоторых бактериофагов, например SP6, T7 с небольшим числом генов простых геномов, где отсутствует сложная регуляция РНК-полимераза состоит из одной субъединицы. Для бактерий и эукариот, с большим числом генов и сложными системами регуляции РНК-полимеразы состоят из нескольких субъединиц. Показано, что фаговые РНК-полимеразы состоящие из одной субъединицы могут взаиодействовать с белками бактерий, которые меняют их свойства [Патрушев, 2000].
У прокариот синтез всех видов РНК осуществляется одним и тем же ферментом.
У эукариот - 3 ядерные РНК-полимеразы, митохондриальные РНК-полимеразы, хлоропластные РНК-полимеразы.
Субстратами для РНК-полимераз служат рибонуклеозид-трифосфаты (активированные нуклеотиды). Весь процесс транскрипции осуществляется за счет энергии макроэргических связей актвированных нуклеотидов.

Первый нуклеотид в РНК всегда пурин в форме трифосфата.
Факторы транскрипции - белки взаимодействующие с друг другом, регуляторными участками ДНК и РНК-полимеразой с образованием транскрипционного комплекса и регулирующие транскрипцию. Благодаря факторам транскрипции и регуляторным последовательностям генов становится возможным специфический синтез РНК.
Принципы транскрипции
комплиментарность - mRNA комплиментарна матричной цепи ДНК и аналогична кодирующей цепи ДНК
антипараллельность
униполярность
беззатравочность - РНК-полимераза не требует праймера
асимметричность
Стадии транскрипции

1. распознавание промотора и связывание - РНК-полимераза связывается с ТАТА-боксом 3’-промотора при помощи основных факторов транскрипции, дополнительные факторы ингибируют или стимулируют присоединение
2. инициация - образование первой фосфодиэфирной связи между Pu и первым нуклеотидом. К пуринтрифосфату присоед нуклеотид комплиментарный второму нуклеотиду ДНК с отщеплением пирофосфата от нуклеозидтрифосфата с образ диэфирной связи
3. элонгация (3’→5’)- мРНК гомологичная нематричной (кодирующей, смысловой) ДНК, синтезируется на матричной ДНК; какая из двух цепей ДНК будет матрицей, определяется направлением промотора
4. терминация

Транскрипционные фабрики

Существует ряд экспериментальных данных, свидетельствующих о том, что транскрипция осуществляется в так называемых транскрипционных фабриках: огромных, по некоторым оценкам, до 10 МДа комплексах, которые содержат около 8 РНК-полимераз II и компоненты последующего процессинга и сплайсинга, а также пруф-ридинга новосинтезированного транскрипта. В ядре клетки происходит постоянный обмен между пулами растворимой и задействованной РНК-полимеразы. Активная РНК-полимераза задействована в таком комплексе, который в свою очередь является структурной организовывающей компактизацию хроматина единицей. Последние данные. свидетельствуют о том, что транскрипционные фабрики существуют и в отсутствие транскрипции, они фиксированы в клетке (пока не ясно, взаимодействуют ли они с матриксом клетки или нет) и представляют собой независимый ядерный субкомпартмент. Попытки выделить белковый функциональный комплекс транскрипционной фабрики пока не привели к успеху ввиду его огромных размеров и низкой растворимости.

Транскрипция у эукариот

РНК-полимеразы эукариот

У эукариот имеется 3 типа РНК-полимераз (не считая митохондриальной и хлоропластной):
РНК полимеразаI - синтезирует в ядрышках рибосомные RNA (18S и 28S рРНК, кроме 5S);
РНК-полимеразаII - синтезирует mRNA и некоторых sRNA;
РНК-полимеразаIII - синтезирует tRNA, sRNA, 5S rRNA.
RNA-полимеразы эукариот отличаются: количеством субъединиц – 2 большие (120-220кДа) и до 8 малых (10-100кДа), потребностью в ионах Mg и Mn, чувствительностью к – амонитину - токсину бледной поганки - пептиду включающему D-аминокислоты: polI - устойчива, polII - ингибируется при концентрации 10-8М, polIII - при 10-6М амонитина. РНК-полимеразы I,II,III кодируются в ядре. Большие субъединицы гомологичны β и β`-субъединицам эубактерий.

РНК-полимераза I

РНК-полимераза II

PolII Человека содержит более 10 субъединиц, слабо ассоциирующих друг с другом. Некоторые из них принадлежат к основным факторам транскрипции (GTF).
Белки holo-фермента PolII дрожжей [Патрушев, 2000].
Pol II - РНК-Полимеразная активность, взаимодействует с множеством общих и тканеспецифических факторов транскрипции, участвует в выборе точки инициации транскрипции.
TFIIB - Связывает Pol II и TBP на промоторе, участвует в выборе точки инициации транскрипции
TFIIF - Взаимодействует с Pol II, стимулирует элонгацию транскрипции Pol II, компонент субкомплекса SRB/медиатор
TFIIH - Активность ДНК-зависимой ATPазы, ДНК-геликазная активность, обладает активностью CTD-киназы
SRB2, SRB5
взаимодействуют с TBP, компоненты субкомплекса SRB/медиатор
GAL11/SPT13 - Участвуют в образовании инициационного комплекса, стимулируют базальный и индуцированный синтез РНК,
компоненты субкомплекса SRB/медиатор, предположительно взаимодействуют с активаторами транскрипции
SUG1 - Компонент субкомплекса SRB/медиатор, предположительно взаимодействует с активаторами транскрипции
SRB4, SRB6, SRB7, SRB8, SRB9, SRB10, SRB11 - Компоненты субкомплекса SRB/медиатор, предположительно
взаимодействуют с CTD-доменом Pol II

РНК-полимераза III

Факторы транскрипции

Инициация

Инициация транскрипции происходит на кэп-сайте кодирующем первый нуклеодид первого экзона мРНК.
ТАТА-бокс локализуется в 25-30 пн выше кэп-сайта связывая РНК-полимеразу перед кэп-сайтом. Промотор - примерно 200 пн выше кэп-сайта. Энхансеры обычно имеют длину 100-200 пн.

Элонгация

Терминация

Терминация на сайте полиаденилирования.

Вновь синтезированная РНК генов связывается с ядерными белками - информомерами, подвергается различным посттранскрипционным модификациям и транспортируется из ядра (см. обзор Процессинг) для последующей трансляции (см. обзор Трансляция).

Транскрипция у прокариот

РНК-полимераза E.coli

РНК-полимераза E.coli осуществляет транскрипцию всех бактериальных генов и состоит из нескольких субъединиц: α-35кДа, β‘-165кДа, β-155кДа, σ-чаще 70кДа (σ70). РНК-полимераза состава ααββ’σ70 называется holo-фермент (Еσ70), состава ααββ’- core-фермент (E).
σ - сменный фактор специфичности, который диссоциирует после инициации транскрипции. Элонгация и терминация осуществляется core-ферментом. У Е.coli ~10 видов σ-субъединиц. Транскрипция генов теплового шока, оперонов gln или nif осуществляется σ54 в составе holo-фермента Eσ54 (54 кДа).
Все субъединицы заряжены отрицательно: σ>α>β>β’ – расположены по убыванию заряда. В каждой субъединице имеется кластер (+)-заряженных участков, которыми они связываются с ДНК. Наибольшее число кластеров у – β’, который участвует в связывании фермента с ДНК, β-субъединица содержит активные центры - инициации и элонгации, α-субъединицы обеспечивают правильное взаимодействие фермента с промоторами. Рифампицин – блокирует инициацию, стрептолидигин – блокирует элонгацию, что говорит о разнесении активных центров в РНК-полимеразе.
Узнавание и связывание RNA-pol с промотором осуществляется holo-ферментом
Одновременно в клетке присутствует около 7000 молекул РНК-полимеразы. Только holo-фермент обладает высоким сродством к специфической последовательности нуклеотидов - промотору, сродство к остальным случайным последовательностям ДНК у него снижено в 10000 раз. У core-фермента одинаковое сродство к любой последовательности нуклеотидов.
Сам по себе сигма - фактор обладает наименьшим сродством к ДНК по сравнению с другими субьединицами РНК-полимеразы, однако он придает holo-ферменту такую конформацию, которая обладает повышенным сродством к промотору.
Стадии узнавания и связывания, а также инициации осуществляются holo-ферментом. Элонгация и терминация осуществляются core-ферментом.
Две α субъединицы - каркас РНК-полимеразы. К ним крепятся остальные субъединицы.
β" - субъединица отвечает за прочное связывание с ДНК за счет кластера положительно заряженных аминокислот.
В β - субъединице находятся два каталитических центра. Один отвечает за инициацию, а другой - за элонгацию. Один центр работает в holo-, а другой - в core- ферменте.

Инициация транскрипции

РНК-полимераза Ecoli узнает два 6н разделенных 25н

Элонгация транскрипции

Терминация транскрипции

Регуляция транскрипции

Схема негативной индукции Жакоба и Моно

Lac-оперон E. coli содержит 3 гена, отвечающие за образование белков, участвующих в переносе в клетку дисахарида лактозы и в ее расщеплении.
Z-β - галактозидаза (расщепляет лактозу на глюкозу и галактозу).
Y-β- галактозидпермеаза (переносит лактозу через мембрану клетки).
А - тиогалактозидтрансацетилаза (ацетилирует галактозу).
В отсутствие в клетке лактозы lac-оперон выключен. Активный белок - репрессор, кодируемый в моноцистронном опероне (LacI) , не имеющем оператора, связан с оператором lac-оперона. Поскольку оператор перекрывается с промотором, даже посадка РНК-полимеразы на промотор невозможна.
Как только некоторое количество лактозы попадает в клетку, две молекулы субстрата (лактозы) взаимодействуют с белком - репрессором, изменяют его конформацию - и он теряеет сродство к оператору.
Тут же начинается транскрипция lac-оперона и трансляция образующейся mРНК; три синтезируемых белка участвуют в утилизации лактозы.
Когда вся лактоза переработана, очередная порция репрессора, свободного от лактозы, выключает lac-оперон.

Схема позитивной индукции

В Аra-опероне E. сoli 3 цистрона, которые кодируют ферменты, расщепляющие сахар арабинозу. В норме оперон закрыт. Белок - репрессор связан с оператором.

Когда в клетку попадает арабиноза, она взаимодействует с белком - репрессором. Белок - репрессор меняет конформацию и превращается из репрессора в активатор, взаимодейсивующий с промотором и облегчающий посадку РНК-полимеразы на промотор.
Эта схема регуляции называется позитивной индукцией, поскольку контролирующий элемент - белок - активатор "включает" работу оперона.

Информация о первичной структуре белковой молекулы содержится в ДНК, которая находится в ядре эукариотической клетки. Одна цепочка – нить ДНК может содержать информацию о многих белках. Ген – это участок (фрагмент) ДНК, несущий информацию о строении одного белка. В молекуле ДНК записан код о последовательности аминокислот в белке в виде определенной последовательности нуклеотидов. При этом каждой аминокислоте в будущей белковой молекуле соответствует участок из трех нуклеотидов (триплет) в молекуле ДНК.

Процесс биосинтеза белка включает в себя ряд последовательно протекающих событий:

Репликация ДНК (в ядре клетки) транскрипция информационная РНК (в цитоплазме с помощью рибосом) трансляция белок

Синтез информационной РНК (и-РНК) происходит в ядре. Он осуществляется по одной из нитей ДНК с помощью ферментов и с учетом принципа комплиментарности азотистых оснований. Процесс переписывания информации, содержащейся в генах ДНК на синтезируемую молекулу и-РНК называется транскрипцией . Очевидно, что информация переписывается в виде последовательности нуклеотидов РНК. Нить ДНК в этом случае выступает в качестве матрицы. В молекулу РНК в процессе ее образования вместо азотистого основания – тимина включается урация.

Г - Ц - А - А - Ц - Т – фрагмент одной из цепочек молекулы ДНК
- Ц - Г - У - У - Г - А – фрагмент молекулы информационной РНК.

Молекулы РНК индивидуальны, каждая из них несет информацию об одном гене. Далее молекулы и-РНК выходят из ядра клетки через поры оболочки ядра и направляются в цитоплазму к рибосомам. Сюда же с помощью транспортных РНК (т-РНК) доставляются аминокислоты. Молекула т-РНК состоит из 70–80 нуклеотидов. Общий вид молекулы напоминает лист клевера.

На «верхушке» расположен атикодон (кодовый триплет нуклеотидов), который соответствует определенной аминокислоте. Следовательно, для каждой аминокислоты существует своя, конкретная т-РНК. Процесс сборки молекулы белка идет в рибосомах и называется трансляцией . На одной молекуле и-РНК последовательно располагаются несколько рибосом. В функциональном центре каждой рибосомы способны поместиться два триплета и-РНК. Кодовый триплет нуклеотидов – молекулы т-РНК, подошедшей к месту синтеза белка, соответствует триплету нуклеотидов и-РНК, находящемуся в данный момент в функциональном центре рибосомы. Тогда рибосома по цепочке и-РНК делает шаг, равный трем нуклеотидам. отделяется от т-РНК и становится в цепочку мономеров белка. Освободившаяся т-РНК уходит в сторону и через некоторое время может снова соединиться с определенной кислотой, которую будет транспортировать к месту синтеза белка . Таким образом, последовательность нуклеотидов в триплете ДНК соответствует последовательности нуклеотидов в триплете и-РНК.

В сложнейшем процессе биосинтеза белка реализуются функции многих веществ и органоидов клетки.

Сначала, установите последовательность этапов биосинтеза белка, начиная с транскрипции. Всю последовательность процессов, происходящих при синтезе белковых молекул, можно объединить в 2 этапа:

1. Транскрипция.

2. Трансляция.

Структурными единицами наследственной информации являются гены – участки молекулы ДНК, кодирующие синтез определенного белка. По химической организации материал наследственности и изменчивости про- и эукариот принципиально не отличается. Генетический материал в них представлен в молекуле ДНК, общим является также принцип записи наследственной информации и генетический код. Одни и те же аминокислоты у про — и эукариот шифруются одинаковыми кодонами.

Геном современных прокариотических клеток характеризуется относительно небольшими размерами, ДНК кишечной палочки имеет вид кольца, длиной около 1 мм. Она содержит 4 х 10 6 пар нуклеотидов, образующих около 4000 генов. В 1961 г. Ф. Жакоб и Ж. Моно открыли цистронную, или непрерывную организацию генов прокариот, которые полностью состоят из кодирующих нуклеотидных последовательностей, и они целиком реализуются в ходе синтеза белков. Наследственный материал молекулы ДНК прокариот располагается непосредственно в цитоплазме клетки, где также находятся необходимые для экспрессии генов тРНК и ферменты.Экспрессия- это функциональная активность генов, или выражение генов. Поэтому синтезированная с ДНК иРНК способна сразу выполнять функцию матрицы в процессе трансляции синтеза белка.

Геном эукариот содержит значительно больше наследственного материала. У человека общая длина ДНК в диплоидном наборе хромосом составляет около 174 см. Она содержит 3 х 10 9 пар нуклеотидов и включает до 100000 генов. В 1977 г. была обнаружена прерывистость в строении большинства генов эукариот, получивший название «мозаичный» ген. Для него характерны кодирующие нуклеотидные последовательности экзонные и интронные участки. Для синтеза белка используется только информация экзонов. Количество интронов варьирует в разных генах. Установлено,что ген овальбумина кур включает 7 интронов, а ген проколлагена млекопитающих – 50. Функции молчащей ДНК – интронов окончательно не выяснены. Предполагают, что они обеспечивают: 1) структурную организацию хроматина; 2) некоторые из них, очевидно, участвуют в регуляции экспрессии генов; 3) интроны можно считать запасом информации для изменчивости; 4) они могут играть защитную роль, принимая на себя действие мутагенов.

Транскрипция

Процесс переписывания информации в ядре клетки с участка молекулы ДНК на молекулу мРНК (иРНК) называется транскрипция (лат. Transcriptio – переписывание). Синтезируется первичный продукт гена- мРНК. Это первый этап белкового синтеза. На соответствующем участке ДНК фермент РНК–полимераза узнает знак начала транскрипции – промотр. Стартовой точкой считается первый нуклеотид ДНК, который включается ферментом в РНК-транскрипт. Как правило, кодирующие участки начинаются кодоном АУГ, иногда у бактерий используется ГУГ. Когда РНК-полимераза связывается с промотором, происходит локальное расплетание двойной спирали ДНК и копируется одна из цепей по принципу комплементарности. Синтезируется мРНК, скорость сборки её достигает 50 нуклеотидов в секунду. По мере движения РНК–полимеразы, растёт цепь мРНК, и когда фермент достигнет конца копирующего участка – терминатора , мРНК отходит от матрицы. Двойная спираль ДНК позади фермента восстанавливается.

Транскипция прокариот осуществляется в цитоплазме. В связи с тем, что ДНК целиком состоит из кодирующих нуклеотидных последовательностей, поэтому синтезированная мРНК сразу выполняет функцию матрицы для трансляции (см. выше).

Транскрипция мРНК у эукариот происходит в ядре. Она начинается синтезом больших по размерам молекул — предшественников (про-мРНК), называемых незрелой, или ядерной РНК.Первичный продукт гена- про-мРНК является точной копией транскрибированного участка ДНК, включает экзоны и интроны. Процесс формирования зрелых молекул РНК из предшественников называется процессингом . Созревание мРНК происходит путём сплайсинга – это вырезания ферментами рестриктаз интронов и соединение участков с транскрибируемыми последовательностями экзонов ферментами лигаз. (Рис.).Зрелая мРНК значительно короче молекул-предшественников про – мРНК, размеры интронов в них варьирует от 100 до 1000 нуклеотидов и более. На долю интронов приходится около 80% всей незрелой мРНК.

В настоящее время доказана возможность альтернативного сплайсинга, при котором из одного первичного транскрипта могут удалятся в разных его участках нуклеотидные последовательности и будут образовываться несколько зрелых мРНК. Данный вид сплайсинга характерен в системе генов иммуноглобулинов у млекопитающих, что даёт возможность формировать на основе одного транскрипта мРНК разные виды антител.

По завершению процессинга зрелая мРНК проходит отбор перед выходом из ядра. Установлено, что в цитоплазму попадает всего 5% зрелой мРНК, а остальная часть расщепляется в ядре.

Трансляция

Трансляция (лат. Translatio — передача, перенесение) — перевод информации, заключенной в последовательности нуклеотидов молекулы мРНК,в последовательность аминокислот полипептидной цепи (Рис. 10). Это второй этап белкового синтеза. Перенос зрелой мРНК через поры ядерной оболочки производят специальные белки, которые образуют комплекс с молекулой РНК. Кроме транспорта мРНК, эти белки защищают мРНК от повреждающего действия цитоплазматических ферментов. В процессе трансляции центральная роль принадлежит тРНК, они обеспечивают точное соответствие аминокислоты коду триплета мРНК. Процесс трансляции- декодирования происходит в рибосомах и осуществляется в направлении от 5 к 3 , Комплекс мРНК и рибосом называется полисомой.

В ходе трансляции можно выделить три фазы: инициацию, элонгацию и терминацию.

Инициация.

На этом этапе происходит сборка всего комплекса, участвующего в синтезе молекулы белка. Происходит объединение двух субъединиц рибосом на определённом участке мРНК, присоединение к ней первой аминоацил – тРНК и этим задаётся рамка считывания информации. В молекуле любой м-РНК есть участок, комплементарный р-РНК малой субединицы рибосомы и специфически ею управляемый. Рядом с ним находится инициирующий стартовый кодон АУГ, который кодирует аминокислоту метионин.Фаза инициации завершается образованием комплекса:рибосома, -мРНК- инициирующая аминоацил-тРНК.

Элонгация

— она включает все реакции от момента образования первой пептидной связи до присоединения последней аминокислоты. На рибосоме имеется два участка для связывания двух молекул т-РНК. В одном участке-пептидильном(П) находится первая т-РНК с аминокислотой метионин и с него начинается синтез любой молекулы белка. Во второй участок рибосомы- аминоацильный (А) поступает вторая молекула т-РНК и присоединяется к своему кодону. Между метионином и второй аминокислотой образуется пептидная связь. Вторая т-РНК перемещается вместе со своим кодоном м-РНК в пептидильный центр. Перемещение т-РНК с полипептидной цепочкой из аминоацильного центра в пептидильный сопровождается продвижением рибосомы по м-РНК на шаг, соответствующий одному кодону. Т-РНК, доставившая метионин, возвращается в цитоплазму, амноацильный центр освобождается. В него поступает новая т-РНК с аминокислотой, зашифрованной очередным кодоном. Между третьей и второй аминокислотами образуется пептидная связь и третья т-РНК вместе с кодоном м-РНК перемещается в пептидильный центр.Процесс элонгации, удлинения белковой цепи. Продолжается до тех пор, пока в рибосому не попадёт один из трёх кодонов, не кодирующих аминокислоты. Это кодон — терминатор и для него не существует соответствущей т-РНК, поэтому ни одна из т-РНК не может занять место в аминоацильном центре.

Терминация

– завершение синтеза полипептида. Она связана с узнаванием специфическим рибосомным белком одного из терминирующих кодонов (УАА, УАГ, УГА), когда он будет входить в аминоацильный центр. К рибосоме присоединяется специальный фактор терминации, который способствует разъединению субъединиц рибосомы и освобождению синтезированной молекулы белка. К последней аминокислоте пептида присоединяется вода и её карбоксильный конец отделяется от т-РНК.

Сборка пептидной цепи осуществляется с большой скоростью. У бактерий при температуре 37°С она выражается в добавлении к полипептиду от 12 до 17 аминокислот в секунду. В эукариотических клетках к полипептиду добавляется две аминокислоты в одну секунду.

Синтезированная полипептидная цепь затем поступает в комплекс Гольджи, где завершается построение белковой молекулы (последовательно возникают вторая, третья, четвертая структуры). Здесь же происходит комплексование белковых молекул с жирами и углеводами.

Весь процесс биосинтеза белка представлен в виде схемы: ДНК ® про иРНК ® мРНК ® полипептидная цепь ® белок® комплексование белков и их преобразование в функционально активные молекулы.

Этапы реализации наследственной информации также протекают сходным образом: сначала она транскрибируется в нуклеотидную последовательность мРНК, а затем транслируется в аминокислотную последовательность полипептида на рибосомах с участием тРНК.

Транскрипция эукариот осуществляется под действием трех ядерных РНК-полимераз. РНК-полимераза 1 находится в ядрышках и отвечает за транскрипцию генов рРНК. РНК-полимераза 2 находится в ядерном соке и отвечает за синтез предшественника мРНК. РНК-полимераза 3 –небольшая фракция в ядерном соке, которая осуществляет синтез малых рРНК и тРНК. РНК-полимеразы специфически узнают нуклеотидную последовательность транскрипции-промотор. Эукариотическая мРНК вначале синтезируется в виде предшественницы (про- иРНК), на нее списывается информация с экзонов и интронов. Синтезированная мРНК обладает большими, чем необходимо для трансляции размерами и оказывается менее стабильной.

В процессе созревания молекулы мРНК с помощью ферментов рестриктаз вырезаются интроны, а с помощью ферментов – лигаз сшиваются экзоны. Созревание мРНК называется процессингом, сшивание экзонов называется сплайсингом. Таким образом, зрелая мРНК содержит только экзоны и она значительно короче её предшественницы – про- иРНК. Размеры интронов варьируют от 100 до 10000 нуклеотидов и более. На долю интонов приходится около 80% всей незрелой мРНК. В настоящее время доказана возможность альтернативного сплайсинга, при котором из одного первичного транскрипта могут удаляться в разных его участках нуклеотидные последовательности и будут образовываться несколько зрелых мРНК. Данный вид сплайсинга характерен в системе генов иммуноглобулинов у млекопитающих, что даёт возможность формировать на основе одного транскрипта мРНК разные виды антител. По завершению процессинга зрелая мРНК проходит отбор перед выходом в цитоплазму из ядра. Установлено, что попадает всего 5% зрелой мРНК, а остальная часть расщепляется в ядре. Преобразование первичных транскриптонов эукариотических генов, связанное с их экзон-интронной организацией, и в связи с переходом зрелой мРНК из ядра в цитоплазму, определяет особенности реализации генетической информации эукариот. Следовательно, мозаичный ген эукариот не является геном цистроном, так как не вся последовательность ДНК используется для синтеза белка.

Биосинтез РНК – транскрипция – процесс считывания генетической информации с ДНК, при котором нуклеотидная последовательность ДНК кодируется в виде нуклеотидной последовательности РНК. Используется в качестве энергии и субстрата – нуклеозид-3-фосфат с рибозой. В основе лежит принцип комплиментарности – консервативный процесс – синтезируется новая одноцепочная РНК во время всей интерфазы, начинается в определенных участках – промоторах, заканчивается в терминаторах, а участок между ними – оперон (транскриптон) – содержит один или несколько функционально связанных генов, иногда содержит гены которые не кодируют белки. Отличия транскрипции : 1) транскрибируются отдельные гены. 2) не требуется праймера. 3) в РНК включается рибоза, а не дезоксирибоза.

Этапы транскрипции: 1) связывание РНК-полимеразы с ДНК. 2) инициация – образование цепи РНК. 3) элонгация или рост цепи РНК. 4) терминация.

1 этап – участок с которым связывается РНК-полимераза называется промотор (40 нуклеотидных пар) – имеет сайт узнавания, прикрепления, инициации. РНК-полимераза узнав промотора садится на него и образуется закрытый промоторный комплекс, в котором ДНК спирализовано и комплекс может легко диссоциировать и переходить в открытый промоторный комплекс – связи прочные, азотистое основание выворачивается наружу.

2 этап – инициация синтеза РНК заключается в образовании нескольких звеньев в цепи РНК, синтез начинается на одной цепи ДНК 3’-5’ и идет в направлении 5’-3’. Стадия заканчивается отделением б-субъединицы.

3 этап – элонгация – удлинение цепочки РНК – происходит за счет Core-рРНК-полимеразы. Нить ДНК деспирализована на 18ти парах, а на 12 – гибрид – общий гибрид ДНК и РНК. РНК-полимераза продвигается по цепочке ДНК, а после восстановление цепочки ДНК. У эукариот когда РНК достигает 30 нуклеотидов на 5’-конце образуется защитная структура КЭП.

4 стадия – терминация – происходит на терминаторах. В цепочке находится участок богатый ГЦ, а затем от 4 до 8 расположенных подряд А. После прохождения участка в РНК продукте образуется шпилька и фермент дальше не идет, синтез прекращается. Важную роль играет белковый фактор терминации – ро и тауэр. Пока шел синтез пирофосфат ингибировал ро белок, т.к. фермент остановился (шпилька) прекратился синтез фосфорной кислоты. Ро белок активируется и проявляет нуклеозидфосфатазную активность, что приводит к высвобождению РНК, РНК-полимеразы, которая в дальнейшем объединяется с субчастицей.

Процессинг – созревание РНК. Включает в себя: 1) образование КЭП на 5’-конце, участвует в присоединение к рибосоме. 2) на 3’-конце происходит полиаденилирование и образуется хвост из ста-двухсот адениловых нуклеотидов, он защищает ‘-конец от действия нуклеаз и помогает проходить через ядерные поры и играет роль в присоединение к рибосоме. 3) сплайсинг – вырезается не кодирующие последовательности – интроны. Это происходит двумя путями: а) осуществляется сплайсосомой – это нуклеопротеид, содержащий ряд белков и малую ядерную РНК. В начале происходит выпетливание интронов, при этом остаются только кодирующие последовательности – экзоны. Ферменты эндонуклеазы разрезают, а лигазы сшивают оставшиеся экзоны. Т.О. интроны уходят. Альтернативный сплайсинг – на одной последовательности нуклеиновой кислоты РНК образуют несколько белков. Самосплайсинг – самостоятельное удаление интронов. Нарушение сплайсинга: 1) системная красная волчанка. 2) фенилкетонурия. 3) гемоглобинопатия. Матричная РНК прокариот не подвергается процессингу, т.к. у них не интронов. Процессинг тРНК . Предшественник тРНК расщепляется и отщепляется нуклеотид 5’-3’ Q P. К 3’-концу присоединяется последовательность ССА с ОН-группой, на 5’ конце фосфорилированое пуриновое основание. Дугидроуридиновая петля – АРСаза. Процессинг рРНК. Предшественник рРНК – прорибосомальная РНК 45S синтезируется в ядрышке и подвергается действию рибонуклеаз и образуется 5,8S 18S 28S. Они на 70% спирализуются. рРНК играет роль в формировании рибосомы и участвует в каталитических процессах. Субъединица формируется из рРНК в ядре. Малая субъединица 30S, большая субъединица 50S и образуется рибосома 70S у прокариот, у эукариот 40S + 60S = 80S. Формирование рибосом происходит в цитоплазме.

Участки рибосом для связывания РНК : 1) в малых субъединицах, у которых есть последовательность Шайна-Далгорна мРНК 5’ГГАГГ3’ 3’ЦЦУЦЦ5’. Матричная РНК крепится к малой субъединице. У эукариот КЭП-связывающий участок для мРНК. Участок для связывания с тРНК : а) Р-участок – пептидильный центр для связывания мРНК с растущей пептидной цепью – пептидил-тРНК-связывающий. б) А-участок – для связи тРНК с аминокислотой – аминоацильный участок 2) В большой субъединице Е-участок с пептидилтрансферазной активность.

Обратная транскрипция характерна для ретровирусов или вирусы содержащие РНК – вирус ВИЧ-инфекции, онковирусы.

На цепочке РНК происходит синтез ДНК под действием фермента обратной транскриптазы или ревертазы, или ДНК РНК -полимераза. Внедряясь в клетку хозяина происходит синтез ДНК, в которая встраивается в ДНК хозяина и начинается транскрипция своих РНК и синтез собственных белков.

Генетический код, его характеристика. Генетический код – это нуклеотидная последовательность молекулы рРНК в которой имеются кодовые слова для каждой аминокислоты. Он заключается в определенной последовательности расположения нуклеотидов в молекуле ДНК.

Характеристика. 1) генетический код триплетный – т.е. каждая а/к-та зашифрована тремя нуклеотидами. 2) генетический код для а/к является вырожденным или избыточным – подавляющее большинство а/к кодируется несколькими кодонами. Всего 64 триплета образуется, из них 61 триплет кодирует определенную а/к, а три триплета – АУГ, УАА, УГА являются нонсенс-кодонами, т.к. они не кодируют ни одной из 20 а/к, выполняют функцию терминации синтеза. 3) Генетический код является непрерывным, отсутствуют знаки препинания, т.е. сигналы, указывающие на конец одного триплета и начала другого. Код является линейным, однонаправленным, непрерывным. Например - АЦГУЦГАЦЦ. 4) кодоном включения синтеза служит триплет АУГ. 5) Генетический код является универсальным.

22. Трансляция – биосинтез белка. Этапы трансляции: 1) инициация. 2) элонгация. 3) терминация. Инициация – происходит активация а/к.

Инициирующая аатРНК будет взаимодействовать с 1 а/к будущего белка только карбоксильной группой, а 1 а/к может давать на синтез только NH 2 группу, т.о. синтез белка начинается с N-конца.

Сборка инициирующего комплекса на малой субчастице. Факторы: 30S мРНК фомилметионил тРНК IF 123 Mg 2+ ГТФ – источник энергии

Нагруженная факторами инициации малая субъединица находит на мРНК старт кодон АУГ или ГУГ и по нему устанавливается рамка считывания, т.е. старт кодон помещается в Р-участок. К нему подходит формлметионил тРНК, что сопровождается высвобождением фактора IF 3, затем присоединяется большая субъединица и высвобождается IF 1 и IF2, происходит гидролиз 1ГТФ и образуется рибосома. Элонгация – рабочий цикл рибосомы. Включает в себя три шага: 1) связывание аатРНК с А-участком т.к. занят Р-участок– нужны факторы элонгации EF-TU, EF-TS и ГТФ.. 2) транспептидирование Е-участок перебрасывает а/к и образуется пептидная связь. Факторы элонгации у прокариот: EF-TU, EF-TS, EF-G. 3)Транслокация – сначала EF-G деацилированная тРНК Р-участка покидает рибосому, происходит перемещение на 1 триплет в сторону 3’ конца; перемещение пептида из А, в Р-участок – используется ГТФ и фактор элонгации – EF-G-транслоказа, А – участок опять свободен и процесс повторяется. Терминация – узнавание терминирующих кодонов УАА, УГА, УАГ с помощью релизинг-факторов RF 1 2 3. При попадании терминального кодона в А-участок к нему не присоединяется тРНК, а присоединяется один из факторов терминации, который блокирует элонгацию, что сопровождается активацией эстеразной активности пептидилтрансферазы участка Е. Происходит гидролиз сложных эфирных связей между пептидом и тРНК, рибосома покидает пептид, тРНК и диссоциирует на субъединицы, которые потом могут быть использованы.

Формирование структуры происходит одновременно с помощью белков-шаперонов – белки теплового шока. На синтез одной пептидной связи расходуется 1АТФ на аминоацилирование тРНК (присоединение аминокислоты), 1ГТФ на связь аатРНК с А-участком и 1ГТФ на транслокацию. Затрата энергии около 4 макроэргических связей на синтез одной пептидной связи.

23. Лактозный оперон. Регуляция репликации осуществляется с помощью концентрации белка Dna и гуанозинтетрафосфата. Основная регуляция экспрессии генов осуществляется на уровне транскрипции (зависит от стадии развития клетки, всех факторов, действия гормонов и других регуляторных компонентов). В разных клетках тканей только 5% генов экспрессируется, 97% молчат – мусорные ДНК – регуляторы транскрипции это хрономеры и ряд регуляторных последовательностей. Если присоединение белка-регулятора к ДНК вызывает транскрипцию, то это позитивная (+) регуляция, если подавление транскрипции – негативная (-) регуляция. Позитивная регуляция – ген выключен, присоединение белка-регулятора приводит к началу синтеза, в итоге ген включается. Т.О. белок-регулятор может быть индуктором или активатором. Негативная регуляция – ген включен, идет синтез РНК, если присоединяется белковый фактор регуляции (ингибитор или репрессор синтеза белка)Д ген выключается. Многие гормоны и другие факторы влияют на присоединение белка регулятора. Лактозный оперон E. Coli – негативная регуляция. Основные элементы его работы: в молекуле ДНК – участок регулятор, промотор, про-оперон и три структурных гена: лаг 1, лаг 2, лаг 3 и терминатор. Лаг 1 – осуществляет синтез фермента лактазы или бета-галактозидазы. Лаг 2 – фермент пермиаза, участвует в транспорте лактозы через мембрану. Лаг 3 – фермент трансацилаза. Регулятор – синтез мРНК на рибосоме, ведет к образованию белка репрессора, он присоединяется к оператору (т.к. имеет сродство), садится на него, а т.к. участки промотора и оперона перекрываются – РНК-полимераза не может присоединиться к промотору и транскрипция выключается. Глюкоза и галактоза обеспечиваю сходство репрессора и оператора. Если сходства не будет, лактоза взаимодействует с репрессором, меняя его трансформацию, и он не садится на оперон, т.к. теряет сходство к нему. РНК-полимераза садится на промотор и начинается транскрипция матричной РНК. Лактоза – это индуктор, а процесс – индукция – форма негативной регуляции, называемая так потому, что транскрипция прекращается из-за присоединения репрессора и его отщепление приводит к началу синтеза. Позитивная регуляция – ТАТА фактор – имеет сходство к участку ТАТА-бокс. ТАТА фактор садится на ТАТА-бокс – сигнал для РНК-полимеразы для узнавания своего промотора, села на него и начала транскрипцию рядом расположенных генов. У прокариот преоблалает негативная регуляция, для эукариот это не выгодно. Участки-энхансеры (усилители транскрипции) + белок-регулятор приводит к усилению транскрипции. Саинсеры + белок-регулятор à выключает транскрипцию и изменяет структуру хромосом.

Согласно принципу последовательности, информация переносится от ДНК к РНК и белкам: ДНК -> РНК -> белок. В связи с этим обратимся к содержанию транскрипции (от лат. transcriptio - переписывание), наряду с репликацией ДНК являющейся важнейшим генно-молекулярным механизмом. Транскрипция во многом похожа на репликацию, но, разумеется, у нее есть и многочисленные особенности. Одна из них состоит в том, что при выяснении содержания транскрипции непременно необходимо учитывать строение генов. Дело в том, что в репликации воспроизводятся все структурные единицы генов, чего нет при транскрипции.

Традиционно ген определяется как единица наследственной информации, детерминирующая выполнение организмом определенной функции. Ген состоит из регуляторной и кодирующей части. Транскрибируется только кодирующая часть, которая состоит из экзонов и нитронов. Такая транскрипция характерна для незрелой РНК. Она находит свое продолжение в окончательной стадии транскрипции, при которой из незрелой РНК исключаются все интроны, а оставшиеся экзоны объединяются. В месте промотора с регуляторной частью гена связывается РНК-полимераза, которая в результате инициирует начало транскрипции на одной из двух цепей ДНК. На рис. 6.8 представлена схема устройства гена эукариотов, а также зрелой и незрелой РНК.

Некоторые из использованных выше терминов, очевидно, нуждаются в характеристике.

Рис. 6.8.

Промотор (от фраиц. promoteur - основатель, инициатор) - это последовательность нуклеотидов ДНК, которая позволяет регулировать экспрессию генов. Он находится около 5"-гена и, следовательно, непосредственно перед той частью гена, которая кодирует РНК. Существенным признаком промотора является его специфическое взаимодействие с ДНК зависимыми белками, которые посредством РНК-полимеразы определяют начало транскрипции. Такие белки называются факторами транскрипции.

Наряду с промотором к регуляторной части гена относятся последовательности нуклеотидов, которые также оказывают существенное влияние на экспрессию генов. Энхансеры (англ, enhancer - усилитель, увеличитель) ее усиливают, а сайленсеры (от англ, silencer - глушитель) подавляют, но не сами по себе, а лишь в случае воздействия на них факторов транскрипции. Пространственное положение энхансеров и сайленсеров не является четко определенным, они могут находиться на меньшем или большем расстоянии от промотора.

Экзон (англ, expressed region - область выражения) - участок гена, кодирующий зрелую РНК и белки. Экзоны являются первичными генетическими единицами, от которых решающим образом зависит облик всего биологического мира. Именно их перекомбинация приводит к образованию новых генов и белков. Всего лишь 1,5% генного состава ДНК определяет синтез белков. Другая часть этого состава либо вообще не транскрибируется, либо определяет строение таких разновидностей РНК, например транспортных РНК, которые не обладают функцией синтеза белков.

Интрон (от англ, intervening regions - промежуточные области) - участок гена, который не содержит информации о зрелых РНК и белках. Биологические функции интронов изучены значительно хуже, чем функции экзонов. Большие споры вызывает также вопрос об их происхождении: то ли они возникли вместе с прокариотами, то ли вместе с эукариго- тами или же даже позже их. В одном гене человека в среднем содержится 8,8 экзона и 7,8 ингрона, но ингроны в среднем приблизительно в 25 раз длиннее экзонов .

После сказанного нетрудно представить в себе в основных чертах весь процесс транскрипции (рис. 6.9).

Рис. 6.9.

Этап инициации. Под воздействием ферментов, в частности энхансеров, присоединившись к промотору, РНК-полимераза разрывает азотистые основания (указаны на рис. 6.9 вертикальными короткими линиями) и выбирает ту ветвь ДНК, которая становится матрицей транскрипции (на рис. 6.9. это нижняя линия). Она также создает глазок транскрипции (на рис. 6.9. это треугольная крышечка). При этом для этапа элонгации обнажается 10-20 пар неклеотидов. Интересно, что в случае транскрипции нет необходимости в формировании праймера, характерного для процесса репликации ДНК. Транскрипция обходится без праймера.

Этап элонгации. Под действием РНК-полимеразы в области транскрипционного глазка формируется РНК. В отличие от ДНК-полимеразы РНК-полимераза не способна корректировать правильность синтеза РНК-цепи и исправлять допущенные ошибки. Если в процессе синтеза возникают затруднения, то движение РНК-полимеразы приостанавливается. В результате вероятность ошибочной сборки РНК снижается. Транскрипция не прекращается, глазок удаляется от промотера. В тех областях, которые миновал глазок, восстанавливается дуплексная структура ДНК. Цепь синтезируемой РНК постепенно удлиняется. Она растет в направлении 5"-3".

Этап терминации. Он наступает в силу воздействия на РНК-полимеразу вспомогательных факторов. Как только область транскрипции достигается экзонуклеазами, транскрипция прекращается, а РНК-полимераза и РНК отделяются друг от друга. ДНК полностью восстанавливает свою дуплексную структуру.

Информация обо всех разновидностях РНК содержится в ДНК. Впрочем, не все они транскрибируются непосредственно на матричной ДНК.

Некоторые РНК являются модификациями ранее транскрибированных РНК. Для нас, знакомящихся с основаниями молекулярной генетики, наибольший интерес представляют РНК, участвующих непосредственно в синтезе белков. Их всего 5 типов (табл. 6.4).

Таблица 6.4

РНК, участвующие в синтеза белков

* Информационная РНК - то же самое, что матричная РНК; ** SPR - сокр. англ. signal recognition particle - частицы, распознающие сигналы.

Транскрипция всех РНК происходит иод действием определенных РНК-полимераз или их сочетаний. В табл. 6.5 приведены основные три типа РНК-полимераз.

Таблица 6.5

Типы РНК-полимераз

’ Малые (короткие) РГК отличаются от длинных РНК. Микро РНК являются разновидностью малых РНК, которые составляют 98% всего рибонуклеотидного материала.

В заключение параграфа отметим, что наряду с прямой транскрипцией возможна и обратная. Способностью транскрибировать РНК в ДНК обладают ретровирусы, в частности ВИЧ, ответственный за СПИД. Ретровирус встраивается в клетку. Специальный фермент обратная транскриптаза осуществляет транскрипцию РНК -» ДНК. Затем на полученной цепи ДНК как на матрице достраивается вторая цепь ДНК. После чего реализуется цикл ДНК -> РНК -» белки. Некоторые эукариоты содержат фермент теломеразу, которая также инициирует обратную транскрипцию. Феномен обратной транскрипции должен учитываться при формулировке принципа последовательности. Он не должен интерпретироваться в качестве отрицания обратной транскрипции.

• Ген состоит из регуляторной и кодирующей части.
• Кодирующая часть гена включает экзоны и нитроны.
• Интроны не транскрибируются в зрелую РНК.
• Транскрипция включает этапы инициации, элонгации и терминации.
• Существуют различные типы и виды как PIIK, так и РИК-полимераз транскрипции.
• Синтез любой РНК осуществляет либо одна, либо несколько полимераз, причем нс без участия белковых ферментов.

• SakharkarM. К., Chow V. Т., Kangueane Р. Distributions of Exons and Introns in the HumanGenome //In Silicio Biology. 2004. Vol. 4. No. 4. P. 387-393.