Подсчет лейкоцитов в камере Горяева – это один из способов определения их количества в крови пациента. Число лейкоцитов зависит от множества факторов, к которым следует отнести скорость образования, выделение из костного мозга, уничтожение. На все перечисленные процессы оказывают непосредственное влияние физиологические факторы. Поэтому постоянная смена числа лейкоцитов у здорового человека возможна. Особенно это видно, если сравнивать результаты утренних и вечерних анализов.

Методика подсчета лейкоцитов в камере Горяева

Данный пробирочный метод состоит из следующих этапов:

1. Пробирка заполняется уксусной кислотой с тиазиновым красителем на 0,4 мл. С помощью капиллярной пипетки берется 20 мкл свежей крови и выдувается в эту же пробирку. Полученная смесь тщательно смешивается.
2. Тонкая стеклянная пластинка, находящаяся в камере, тщательно вытирается, после чего образуются радужные разводы.
3. Далее берется капля полученного раствора из крови с уксусной кислотой и подносится к краю пластинки.
4. Когда камера будет заполнена, ее не беспокоят в течение одной минуты, чтобы белые клетки крови начали оседать.
5. При малом увеличении производится подсчет лейкоцитов.

Чтобы получить верные результаты, используют специальную формулу для подсчета количества лейкоцитов в 1 мкл крови. Нормой считается показатель от 4 до 9 на 10 л.

Если получился результат, превышающий данную отметку, то пациенту ставится диагноз - лейкоцитоз. Если наблюдается снижение – лейкопения. Но это в теории, на деле нужно смотреть и на другие показатели, чтобы точно определить заболевание.

Для подсчета лейкоцитов используют три вида формул:

• Для 64 пустых квадратов

N = m x 4000 x 20/(64 x 16) = m x 78.13 ≈ m x 78

• Для 169 пустых квадратов

N = m x 4000 x 20 / (169 x 16) ≈ m x 29.6

• Для 100 пустых квадратов

N = m x 4000 x 20 / (100 x 16) ≈ m x 50.

Камера Горяева – это прибор, который может наиболее точно подсчитать число лейкоцитов, а также других подобных частиц. В ее состав входит специальное толстое стекло с прямоугольной камерой. На ней расположена микроскопическая сетка и тоненькое оптическое стекло.

Этот аппарат разрабатывал известный профессор Горяев Николай Константинович, который трудился в Казанском университете. Его специфическая сетка давала наиболее точные результаты, чем камеры других известных ученых.

Что касается обслуживания камеры, то здесь тоже существуют свои нюансы. В перерывах от работы камера Горяева должна находиться в сухой зоне. Когда работа завершена, ее нужно обработать. Для этого аппарат погружают в этиловый спирт (70%) на полчаса. Другой вариант очистки – это раствор формалина (4%) на один час. Завершающим этапом становится промывка камеры Горяева дистиллированной водой и протирка мягкой тканью.

Существуют случаи, когда при низких показателях в организме пациента все в порядке. Это говорит о том, что основной резерв лейкоцитов находится в тканях. У таких людей предрасположенность к различным заболеваниям очень низка, поэтому они редко болеют. В основном это наследственность.

Лейкопения и лейкоцитоз

Предположить, что у пациента диагноз лейкопения, можно также с помощью камеры Горяева. Ее делят на органическую и функциональную.

К функциональным отклонениям относят:

• заболевания, носящие вирусную или бактериальную этиологию (кишечные инфекции, гепатит А и другое);
• реакция на некоторые медикаменты;
• при сильной нагрузке на мышцы, стрессы, диеты;
• при неправильном хранении крови.

К органическим причинам можно отнести:

• панмиелофтиз;
• лейкоз;
• болезнь Ходжкина;
• ревматическая болезнь;
• облучение ионами;
• агранулоцитоз.

Лейкоцитозом организм отвечает в том случае, когда на него оказывают влияние эндогенные и экзогенные факторы. На практике выделяют физиологическую, а также патологическую формы болезней.

мл. В видалевские пробирки пипеткой

При внесении 0,02 мл крови в 0,4 мл уксусной кислоты получается разведение в 20 раз, что требуется для подсчета лейкоцитов.

Для подсчета форменных элементов разведенную кровь помещают в счетную камеру, в которой клетки располагаются в один слой. Зная объем камеры и разведение крови, высчитывают количество форменных элементов в 1 л крови.

Устройство камеры и сетки Горяева. Камера Горяева (рис. 37) представляет собой толстое предметное стекло, прорезанное четырьмя поперечными бороздами. Борозды делят стекло на пластинки - две боковые и среднюю. Средняя пластинка на 0,1 мм ниже боковых. Она разделена поперечной бороздкой на 2 равные части. На каждой половине средней пластинки нанесена сетка Горяева.

Принадлежностью камеры служит шлифованное покровное стекло. Его следует наложить так, чтобы оно покрыло обе боковые и среднюю пластинки. Нажимая большими пальцами на края стекла, его притирают к боковым пластинкам до появления радужных колец (коль- ^1 ца Ньютона).

Так как боковые пластинки выше средней, между нею и покровным стеклом остается щель. Это и есть камера, в ЩШ

которую заливают разведенную кровь. Глубина камеры 0,1 мм.

Нанесенная на дно камеры сетка Горяева квадратна. Сторона ее - 3 мм, площадь - 9 мм2. Сетка разграфлена на 225 больших квадратов-15 по горизонтали и 15 по вертикали. Часть больших квадратов (через два на третий) разделена на 16 малых квадратов. Сторона малого квадрата равна 1/20 мм (рис. 38).

Техника подсчета. Правильное заполнение счетной камеры разведенной кровью обеспечивает точность подсчета форменных элементов. Перед заполнением камеры содержимое пробирки перемешивают, вращая ее между ладонями в течение 2 мин. Разведенную кровь наносят на среднюю пластинку камеры пастеровской пипеткой с баллоном или стеклянной палочкой, помещая ее около края покровного стекла. По закону капиллярности жидкость затекает под стекло, заполняя камеру.

После заполнения камеру нужно положить на стол на 2-3 мин, пока движение жидкости в ней не прекратится и клетки не расположатся неподвижно на фоне квадратов сетки. При заполнении камеры жидкость не должна стекать в борозды. Недопустимо попадание в камеру пузырьков воздуха.

Подсчет производят под малым увеличением микроскопа (об.8, ок.10 или 15), конденсор должен быть опущен, а диафрагма закрыта.

Подсчет эритроцитов производят в 5 больших квадратах сетки Горяева, разграфленных на 16 малых и расположенных по диагонали. Последнее условие связано с тем, что форменные элементы распределяются по сетке не абсолютно равномерно и подсчет их нужно производить на различных ее участках.

Подсчет лейкоцитов производят в 100 больших нераз-графленных квадратах, расположенных по всей сетке группами по четыре.

Для того чтобы дважды не сосчитать одни и те же клетки, лежащие на пограничных линиях, следует соблюдать следующие правила: к данному квадрату принадлежат клетки, находящиеся большей своей половиной внутри него; клетки, разделенные пограничной линией пополам, считают только на верхней и левой границе квадрата; клетки же, лежащие большей своей половиной вне данного квадрата не считают вовсе.

После подсчета эритроцитов в камере определяют их количество в 1 мкл крови. Для этого полученное при подсчете число эритроцитов умножают на 10 000. Этот коэффициент получен при следующем расчете: в 1 большом квадрате сетки содержится 16 малых, а в 5 больших Квадратах - 80 малых (16-5). Сторона малого квадрата

равна "/го мм, а его площадь "/и-"/20="/«о мм2. Высота^ камеры "/ю мм, следовательно объем крови над малым квадратом составляет:

1 1 1 з 400"l0 4000 ММ Если количество эритроцитов, подсчитанное в 5 больших квадратах или 80 малых, обозначить буквой а, то количество эритроцитов в одном малом квадрате будет

равно. Как указано, объем крови над малым квадратом

равен -- мм3, поэтому для того, чтобы узнать количество эритроцитов в 1 мкл, т. е. в объеме, в 4000 раз большем, необходимо количество эритроцитов, содержащееся в одном малом квадрате ^, умножить на 4000.

Кровь для подсчета эритроцитов была разведена в 200 раз. Чтобы узнать количество эритроцитов в цельной крови, полученную дробь умножают на разведение:

Это математическое выражение можно пред80

ставить в виде сомножителей:

Дробный сомножитель состоит из постоянных величин. При их подсчете получают 10 000 и все выражение приобретает следующий вид: а -10 000. Итак, количество эритроцитов в 1 мкл крови равно числу эритроцитов, подсчитанному в пяти больших квадратах сетки Горяева, умноженному на 10 000.

Например: в 5 больших квадратах сетки Горяева сосчитано 427 эритроцитов. В 1 мкл крови количество эритроцитов будет равно 427-10 000=4 270 000, или 4,27-106.

Для того чтобы определить содержание эритроцитов в 1 л крови, нужно число эритроцитов, выраженное в миллионах, умножить на 10 . В нашем примере количество эритроцитов в 1 л крови равно 4,

КАМЕРЫ СЧЁТНЫЕ - приборы для подсчета форменных элементов крови, мочи и цереброспинальной жидкости, а также микроорганизмов. Предложена К. с. франц. физиологом Малассе (L. Ch. Malassez) в 1874 г.

К. с. представляют собой толстое предметное стекло с углублением, на дне к-рого выгравирована счетная сетка; над углублением накладывают шлифованное покровное стекло. Постоянная высота К. с. обеспечивается плотным притиранием покровного и предметного стекол до образования радужных ньютоновых колец (полосы интерференции).

Структурными элементами всех типов сеток являются большие и малые квадраты. Сетки различных типов - Тома, Бюркера, Предтеченского, Тюрка, Нейбауэра, Горяева, Фукса - Розенталя и др.- отличаются различным группированием больших и малых квадратов.

Известные величины - высота камеры, площадь сетки и ее делений и разведение взятой для исследования крови - позволяют высчитать количество форменных элементов в определенном объеме (1 мкл) крови (или другой среды).

Различают открытые и закрытые К. с. В закрытой камере покровное стекло притирают после ее заполнения, и при этом в нее могут попасть пузырьки воздуха. Такие К. с. (Тома - Цейсса с сеткой Тома, Дунгера с особой сеткой) неудобны в работе и не используются.

Открытые камеры (рис. 1) заполняются после притирания покровного стекла. Они имеют две сетки на одном предметном стекле. Пластинки с выгравированными сетками отграничены желобками одна от другой, а также от остальной части предметного стекла. Наличие желобков дает возможность регулировать заполнение камер. Некоторые камеры снабжены металлическими зажимами, фиксирующими покровное стекло.

Открытые К. с. впервые описал С. П. Алферов в 1883 г., затем в 1905 г. Бюркер (К. Burker). Известны открытые счетные камеры Ключарева, Гауссера и Леви, Гельбера, Глауберманна. В СССР широко применяются счетные камеры Горяева и Фукса - Розенталя. Камера Горяева с сеткой Горяева (рис. 2) имеет объем 0,9 мкл, площадь сетки 9 мм 2 . Сетка состоит из 225 больших квадратов; из них 100 - пустые, 25 - разделены каждый на 16 малых квадратов, 100 - разделены полосами.

Счетная камера Фукса - Розенталя с сеткой Фукса - Розенталя (рис. 3) имеет объем 3,2 мкл, площадь сетки 16 мм 2 , она состоит из 256 больших квадратов (квадраты, разделенные полосами, не считают).

Методика работы

Перед работой предметное стекло К. с. и шлифованное покровное стекло моют под струей водопроводной воды и насухо вытирают. Затем плотно притирают покровное стекло к камере (до появления радужных ньютоновых колец, ибо только при этом условии объем К. с. постоянен).

Содержимое пробирки перед заполнением камеры несколько раз перемешивают, затем оплавленным концом стеклянной палочки отбирают из пробирки, наклоняя ее, каплю крови и наносят на предметное стекло у самого края покровного стекла. Если одной капли крови недостаточно для полного заполнения К. с., добавляют еще каплю. Если кровь взята в смеситель, то первые капли из капилляра смесителя выпускают, а К. с. заполняют каплей из ампулы смесителя. Остатки жидкости с предметного стекла удаляют марлевым тампоном. Подсчет начинают через 3 мин. после заполнения камеры (за это время происходит оседание форменных элементов крови) под микроскопом при малом увеличении (объектив X 8, окуляр X 10 или X 15) и затемненном поле зрения (с прикрытой диафрагмой или при несколько опущенном конденсоре). Счету подлежат клетки, лежащие внутри квадрата (рис. 4). Клетки, пересеченные сторонами квадратов, считают следующим образом: если более половины клетки находится внутри квадрата, то ее считают, если вне - ее не считают. Клетки, пересекаемые линиями точно посередине, считают на двух смежных, правой и верхней, линиях квадратов и не считают на двух других. При использовании соответствующих разводящих р-ров эритроциты, лейкоциты, тромбоциты, эозинофилы, базофилы и ретикулоциты могут быть подсчитаны в камере Горяева.

Эритроциты считают в 80 малых квадратах, т. е. в 5 больших квадратах, расположенных по диагонали. Расчет проводится по формуле:

X = a*4000*200/80,

где а - количество эритроцитов, подсчитанное в 80 малых квадратах, 80 - количество сосчитанных малых квадратов, 200 - степень разведения крови, 4000 - множитель для получения содержания эритроцитов в 1 мкл крови (объем малого квадрата 1/4000 мкл). Практически количество эритроцитов, подсчитанное в 5 больших квадратах, умножают на 10 000.

Лейкоциты подсчитывают в 1600 малых квадратах (в 100 больших квадратах). Расчет проводится по формуле:

X = a * 4000 * 20 /1600,

где а - количество лейкоцитов, подсчитанное в 1600 малых квадратах, 1600 - количество сосчитанных малых квадратов, 20 - степень разведения крови, 4000 - множитель для получения содержания лейкоцитов в 1 мкл крови. Практически количество лейкоцитов, подсчитанное в 1600 малых квадратах, умножают на 50.

Тромбоциты подсчитывают в 400 малых квадратах (25 больших квадратах по диагонали сетки). Реактивами для разведения могут быть изотонический р-р хлорида натрия, различные р-ры, консервирующие тромбоциты и гемолизирующие эритроциты.

Считают тромбоциты под обычным микроскопом и с помощью фазово-контрастного устройства (см. Фазово-контрастная микроскопия) для более четкого выявления их. После разведения пробирку с кровью оставляют на 25-30 мин. для гемолиза эритроцитов. Затем содержимое пробирки повторно перемешивают и заполняют К. с., к-рую помещают на 5 мин. во влажную камеру (напр., чашки Петри с влажной ватой) для оседания тромбоцитов. Расчет проводят по формуле:

X = a*4000*200/400,

где а - количество тромбоцитов, подсчитанное в 400 малых квадратах, 200 - степень разведения крови, 400 - число сосчитанных малых квадратов, 4000 - множитель для получения содержания тромбоцитов в 1 мкл крови. Практически количество тромбоцитов, подсчитанное в 400 малых квадратах, умножают на 2000.

Количество базофилов и эозинофилов подсчитывают в камере Горяева в 1600 малых квадратах, как и лейкоциты. Практически подсчитанное количество базофилов и эозинофилов умножают на 50.

Ретикулоциты подсчитывают в камере Горяева в 80 малых квадратах, как эритроциты. Практически подсчитанное количество ретикулоцитов умножают на 10 000.

Определение общего количества клеток в цереброспинальной жидкости (см.) лучше производить в камере Фукса - Розенталя (из-за небольшого числа лейкоцитов в цереброспинальной жидкости). Подсчитывают по всей сетке (256 больших квадратов) под малым увеличением микроскопа (окуляр X 15, объектив х 8).

При очень большом количестве клеток допускается подсчет половины сетки (с последующим умножением результата на 2). Расчет проводят по формуле:

X = a*11/3,2*10,

где а - количество клеток, подсчитанное в 256 квадратах, 11/10- степень разведения, 3,2- объем камеры в мкл. Практически при подсчете в камере Фукса - Розенталя число лейкоцитов делят на 3.

В камере Горяева клетки цереброспинальной жидкости считают не менее 3 раз (также всю площадь), каждый раз заполняя камеру заново, затем берут среднее арифметическое. Расчет проводят по формуле:

X = a*11/0,9*10,

где а - среднее арифметическое количество клеток, подсчитанное по всей сетке, 11/10 - степень разведения, 0,9 - объем камеры в мкл. Практически число подсчитанных лейкоцитов умножают на 1,2.

Количественное определение форменных элементов в моче проводит в камерах Фукса - Розенталя, Горяева: подсчет эритроцитов и лейкоцитов при среднем увеличении микроскопа, подсчет цилиндров - при малом. Степень разведения мочи зависит от метода исследования (см. Моча).

Подсчет в К. с. не вполне точен. Ошибка метода составляет от 10 до 20% в зависимости от количества подсчитываемых элементов.

Уход и условия хранения

Следует предохранять камеры от загрязнения и попадания пыли на сетку. После работы камеру и покровное стекло моют под струей водопроводной воды и осторожно, но тщательно вытирают чистой салфеткой (можно марлевой). Затем завертывают в бумагу и убирают в коробку.

Библиография: Справочник по клиническим лабораторным методам исследования, под ред. Е. А. Кост, с. 22, М., 1975.

Д. Н. Ишмухаметов